行业导读

当前位置：首页 | 行业资讯

黄曲霉毒素技术资料汇编

编辑：未知作者：admin 来源：未知

一、黄曲霉毒素简介

黄曲霉毒素（Aflatoxin）是常见霉菌——黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）中产毒菌株的代谢产物。黄曲霉在自然界的存在较寄生曲霉普遍，此菌能在受侵染的粮食和油料作物（尤其是玉米和花生）上生长繁殖产生毒素。1960年，英国曾发生了约十万只火鸡幼仔短短几个月内相继死亡的严重事故，后来查明是由于火鸡吃了含有霉变花生饼的饲料引起的，并从霉变的花生饼中分离出黄曲霉产毒菌株。1961年即证实了喂饲含有黄曲霉毒素的花生饼可使大鼠发生原发性肝癌。此后，人们对黄曲霉毒素的种类。理化性质、毒性、致癌性、去毒方法以及与人类肝癌的关系等方面做了大量的研究。

1．黄曲霉毒素的种类及理化性质

黄曲霉毒素是一类结构相似的化合物的总称。其基本结构都有一个二呋南环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。最初根据其在紫外光下发生荧光的颜色及薄层层折时Rf值的不同分别命名为黄曲霉毒素B₁、B₂和G₁、G₂。在365nm波长下B₁、B₂呈蓝紫色荧光；G₁、G₂呈黄绿色荧光。以后又发现这类毒素在动物体内的代谢产物，种类有黄曲霉毒素P₁、M₁、M₂、CM₁等等。其中黄曲霉毒素B₁的化学结构式如图。

黄曲霉毒素可溶于多种溶剂中，如氯仿、甲醇等，但不溶于已烷、石油醚与乙醚中，在紫外光照射下毒素可产生很强的荧光，此种毒素用有机溶剂提取净化后，可在硅胶板上作薄层层析。

2．黄曲霉毒素的毒性

黄曲霉毒素对包括家禽和家富在内的若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。大多数产毒黄典霉菌产生黄曲霉毒素B₁的量比其它黄曲霉毒素多，而且B₁的毒性又最大，因此，一般以B₁ 作为动物毒性试验。动物因种类、性别、年龄、营养状况不同对黄曲霉毒素B₁的敏感性有很大差异，最敏感的动物为鸭雏。

动物急性中毒时主要表现为食欲下降，体重减轻，死后解剖肉眼可见肝脏出血、坏死；。病理变化主要表现为肝实质细胞变性、坏死、脂肪侵润，纤维化及胆管上皮细胞增生，一次小剂量的黄曲霉毒素造成的生理变化是可以恢复的，如果多次重复摄入则可成不可恢复性病变。除肝脏外，其它脏器如脾、肾、睾等亦可引起退行性病变。

此外，有人以黄曲霉毒素对大鼠进行了连续四代的繁殖试验，第一代和第二代的饲料中各含有黄曲霉毒素量0、l、10ppb，其它两代的饲料中含有10ppb浓度的黄曲霉毒素，并一直喂至21月龄。结果发现，喂低量的雌雄鼠的生存率比对照组（无毒的）高。三代的受孕率相似，仔鼠的存活率与断奶鼠的体重，不论其饲料中含黄曲霉毒素量为1或10ppb，也不论喂养时间的长短，都无显著性差异。特别是，未有一只实验动物发生肝癌，只是饲以含黄曲霉毒素B₁ 100ppb达76周之久的大鼠肝脏损害率比对照组高。

黄曲霉毒对实验动物的生物化学影响，一般认为可影响一些与肝脏有关的酶活性变化，如使血清中异柠檬酸脱氢酶、碱性磷酸酶、转氨酶的活性增高，有人还认为可影响酶和脂肪的代谢。

3．黄曲霉毒素的致癌性

黄曲霉毒素可使鱼类和哺乳类动物诱发肝癌，已有许多报道，这是值得注意的重要问题。各种动物对黄曲霉毒素致癌的敏感性不同，如以最低致癌剂量比较，鱼最敏感，在其饲料中含有黄曲霉毒素B₁0.1ppb，1个月后即可引起肝癌；大鼠饲料中含黄曲霉毒素B₁15ppb，67周后导致肝癌。大鼠致癌试验中，大剂量数次摄入和小剂量反复摄入都可导致大鼠发生肝癌，后者出现较前者迟，这说明黄曲霉毒素在致癌性上存在着“剂量与反应”的关系。关于猴的致癌试验，有报导一例雄猴，每日每公斤摄入典曲霉毒素B₁0.02mg，5年半年后发生巨大肝细胞癌。

黄曲霉毒素除主要可引发肝癌外，由于毒素侵入试验动物的途径不同，也可引起其它部位如肾、胃、支气管、腺体和皮下组织的癌肿。

有人曾将黄曲霉毒素B₁与过去认为致癌性极强的一些化合物进行比较，例如对大白鼠经口摄入致肝癌量，黄曲霉毒素B₁为10微克/天，而二甲基亚硝胺则需750微克/天，奶油黄为9000微克/天，由此可见黄曲霉毒素B₁是已知致癌化学物质中的最强的一种。

4．黄曲霉毒素在体内的代谢

阐明黄曲霉毒素在机体中的代谢情况，对了解其中毒与致癌机理有一定的帮助。有关黄曲霉素素B₁的代谢情况，现已初步明确以下几点：

动物摄取黄曲霉毒素B₁后，在体内形成代谢物M₁。M₁是B₁的羟基化衍生物，最初在羊奶中发现，故命名。牛、羊等动物食入含有黄曲霉毒素B₁的饲料后，其奶中即有M₁排出。例如给牛喂饲含有黄曲霉毒素的饲料后12至24小时，奶中即出现有毒性的代谢物，但2至5日后即不能测出具有与B₁相等的毒性的代谢物。猴摄入B₁后尿中排出代谢物为P₁。P₁是B₁的去甲基衍生物，因而代以一个酚基命名。

动物摄入B₁后，在奶、尿液、血液中都有B₁或其它代谢物检出。组织器官中以肝脏最为重要，各种动物肝脏均有B₁或其它代谢物出现，肾、脾、肾上腺中亦可含有B₁，但在肝脏中的蓄积作用显著较其它组织高，这可能由于肝脏是体内进行物质代谢过程的主要器官，许多有毒物质往往在肝脏中进行代谢后，再由肾脏排出，因此尿液中亦有B₁及其代谢物的出现。

5．黄曲霉毒素与人类健康的关系问题

黄曲霉菌在自然界中普遍存在，很容易污染食品，而且能在粮食及油料等食物上生长繁殖产生毒素。其中最易污染的食品是花生、玉米，其次是小麦、薯干，大米等亦常受污染，比较不易受污染的是豆类，但并非所有黄曲霉菌都是产生毒素的产霉菌株，而且产毒菌株产生毒素也需要一定的条件，并受很多因素的影响，最重要的影响因素是湿度和水份。黄曲霉菌繁殖的温度为20℃至40℃，最适宜温度为37℃左右，湿度为85％以上，当温度在20-32℃，湿度为85％以上时，产生黄曲霉毒素最高，毒素主要在菌丝体中产生，分泌到受污染的食品或培养基中。

黄曲霉毒素虽然对动物有强烈的毒性和致癌性，而且有些食物确实受到重惩污染，但对人类的危害，迄今为止，只有间接的验证，尚缺直接的证据，但根据一些流行病学的调查和研究结果表明，世界上许多肝癌高发区，食品的黄曲霉毒素污染率较高。江苏省启东市是全国肝癌发病率最高的地区，据一些专家研究显示这与当地人们对粮食储存方法不当，再加上气候温暖潮湿，粮食受黄曲霉菌污染所致。

6．预防措施

黄曲霉及其毒素应以防霉为主。如前所述，粮食中霉菌生长繁殖的条件主要是适宜的温度和水份，尤其水份更为重要，因此，最切实可行的防霉措施是控制粮食作物在收获后的水份含量。一般来说，粮食作物在收获以后迅速把水份含量（一般可达25％）降至14％以下，使环境相对湿度不超过70％，温度降至10℃以下，就可防止霉菌的生长与产毒。因此，粮食作物在收获以后，应避免长时间堆放在田间，并应及时搬运到场地散开通风。特别是南方一些地区，气候比较炎热潮湿，收获后又经常遇到阴雨，尽快设法使其干燥，防止霉菌的繁殖，尤为重要。

经验证明，保持粮粒和花生外壳的完整，可以有效地防止黄曲霉菌的侵染，在收获、储存、运输各个环节中对这一点均应予以注意。

防止粮食在储存过程中的发热霉变，目前还试用一些化学薰蒸剂，如溴甲烷、二氯乙烷、环氧乙烷等。前两种是杀灭仓库害虫的薰蒸剂，主要通过它们杀灭仓虫，防止虫体表面沾染的霉菌菌丝孢子而播散；环氧乙烷用来防霉，效果较好，据某单位试用，每立方米用100-200克，封闭数日，可使米粒的霉菌数减少90％以上，并且效用可维持4个月，环氧乙烷为无色液体，沸点10.7℃，易燃，挥发快，上述试验于开封后第五日即测不出残留量。但环氧乙烷对人体有毒，使用时需注意安全，同时关于环氧乙烷的残留量和残留量标准，尚待进一步研究。

7．去毒

黄曲霉毒素十分耐热，加热到200℃才能完全被破坏，因此一般烹调加工法均不能彻底破坏毒素。当粮食作物已被黄曲霉毒素污染时，如何去毒是一个复杂的问题，而且由于粮食作物数量大，种类多，也给去毒工作带来一定的困难。

目前去毒方法大部分研究国内尚处于试验阶段，当前实际应用的有以下几种：

（l）人工或机械捡除霉粒：此法适用于花生仁，效果较好。由于黄曲霉毒素主要集中在霉坏、破损、皱皮及变色的花生粒中，因此只要从花生仁中挑除霉坏粒即可使黄曲霉毒素含量大为降低，经严格挑选后可达到容许量标准以下，有人试验100斤花生仁，经挑选后霉粒控制在30粒以下，则其黄曲霉毒素含量可降至5ppb以下。

（2）植物油的碱去毒：油料作物的种子污染黄曲霉毒素后，榨出的油中亦含有毒素。用碱炼法去毒，能达到较满意的效果，而碱炼法本来就是油的一种精制方法。具体作法是用1％的烧碱精炼，再用水洗两次（10份油用1份水），然后再用白陶土90℃作用5-30分钟，油中的黄曲霉毒素含量可降至5ppb以下，碱炼法去毒的原理是NaOH可打破黄曲霉毒素B₁的六碳环内酯，变成香豆毒素盐，其反应如下：

如加盐酸，香豆素盐可变为黄曲霉毒素B₁，但香豆素盐溶于水，在水洗时可被洗去。

（3）对于喂饲动物霉变较厉害的饲料时，可通过在饲料中添加蛋白质含量较高的鱼粉等饲料也可大大降低黄曲霉毒素对动物的危害。

（4）容许量标准的制订，食品中有害物质容许量的制订，除了对人民健康提供保障外，也还能促进食品的生产，保障人民的生活需要。黄曲霉毒素在食品中的容许量，许多国家也都向低的趋势发展，但这只有在防霉去毒的措施跟上后，容许量也才有减低的基础，世界卫生组织、（WHO）建议自1975年4月1日起将1970年所规定的果实及其产品中的黄曲霉毒素的“可行性标准”（“actionable level”）由20ppb降至15ppb以下，在将来随着检验水平的提高，限量标准将进一步下降。目前，我国对一般食品容许量是5ppb，在加入WTO后，容许量将下降到0.1～1ppb。

二、酶联免疫吸附检测技术简介

酶联免疫吸附分析法（ELISA）是六十代出现的新的免疫测定技术，当时主要用于临床诊断上来检测药物、蛋白和病毒，经过三十多年的不断改进与完善，已成为一种不可替代的普遍运用的分析方法。正是该方法在临床诊断上的巨大成功，引起了许多食品分析专家的兴趣，并于七十年代末开始将该方法用于食品卫生分析的研究和应用，经过二十几年的努力探索，取得了显著的进展，从整体上提高了食品卫生分析方法的技术水平。下面就此分析方法的原理、特点、应用及发展作一介绍。

1．酶联免疫吸附分析法的基本原理及特点：

酶联免疫吸附分析法是把抗原抗体免

1 1、ELISA间接法示意图 2、ELISA双抗体夹心法示意图

疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术主要的依据有三点：第一，抗原（抗体）能结合到固相载体的表面仍具有其免疫活性；第二，抗体（抗原）与酶结合所形成的结合物仍能保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原（抗体）反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体（抗原）的含量。酶联免疫吸附分析法主要有三种测定方法：即间接法，抗体夹心法和竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品卫生分析。三种方法原理如图所示：

1、抗体吸附于固相载体

2、加入酶标记抗原及未知抗原（a） 2、加入酶标记抗原及未知抗原（b）

3、加底物（a） 3、加底物（b）

a和b的颜色差别等于未知抗原的量

3、ELISA竞争法示意图

竞争酶联免疫吸附分析法（CELISA）技实验操作步骤的不同又可分成直接竞争法和间接竞争法。直接竞争法主要有三步：第一步，将抗体吸附于固相载体，温育后清洗；第二步，加入含有抗原的待测液及酶标记的抗原，温育后清洗；第三步，加入酶底物，温育后显色，结果判断。而间接竞争法主要有四步：第一步，将人工抗原吸附于固相载体，温育后清洗；第二步，加入含有抗原的待测液和抗体，温育后洗涤；第三步，加入酶标抗体，温育后清洗；第四步，加酶底物，温育后显色，结果判断。

由于食品卫生分析中所需测定的物质大都是小分子量的，而免疫动物产生抗体的抗原其分子量要求必须很大（至少50000），因此，首先必须将小分子物质结合上高分子蛋白质，才能作免疫之用，而为了能使小分子物质结合上高分子蛋白质，则必需在小分子物质上导入一个活性基因（即“剂连剂”），同时直接竞争法所需的酶标抗原的制备也需首先在小分子物质上导入一个活性基因。由于该化学修饰反应有一定的技术难度，有关专家就采用了间接竞争法来改进此测定步骤，用酶标抗体代替了酶标抗原，因为酶标抗体的制备技术相对比较成熟，并有现成的商品，然而这却使整个实验操作过程不如直接竞争法那么简便快捷。

酶联免疫吸附分析法（ELISA）与薄层层析法（TLC）相比，有以下特点；

（1）灵敏度高：酶联免疫吸附分析法最低检出量可达pg级，并可定量测定，而薄层层析法最低检出量只有ng级，并且只能限量测定。

（2）干扰小：抗体抗原免疫反应特异性很强，从而降低了薄层层析法中存在的有色物质，荧光物质和结构类似物的干扰。

（3）测定步骤简便、快速：由于ELISA法干扰小，特异性强，简化了样品的预处理和纯化过程，同时操作步骤也非常简便，测定时间因而也就大大缩短。

（4）操作安全、无污染：由于灵敏度高，标准品浓度就很低，使操作者减少了接触高浓度有毒物质的机率，同时减少了对环境的污染。

酶联免疫吸附分析法（ELISA）与高效液相色谱法（HPLC）相比同样具有特异性很强，干扰小，样品的预处理简便，快速，高效的特点，且设备装置的投资比后者降低了许多，大大节省了测试成本。

2．酶联免疫吸附分析法在食品卫生分析中的应用：

2.1 真菌毒素

真菌毒素在食品卫生理化检验项目中占有一定的比例，且日益受到人们的重视。过去普遍采用的是薄层层析法测定，由于该方法的局限性限制了应用面。1977年，Lawell首先采用了ELISA法来检测黄曲霉毒素，利用小分子黄曲霉毒素B₁结合蛋白质免疫动物得到抗黄曲霉毒素B₁的免疫球蛋白（抗体），并合成了酶标黄曲霉毒素B₁结合物，建立了直接竞争 ELISA法检测黄曲霉毒素B₁。随后美国学者朱繁生教授，英国学者Morgen教授分别改进了直接法和建立了间接竞争ELISA法。我国1987年李秀芳等建立了直接竞争ELISA法，刘滨磊、计融等建立了间接ELISA法。并将该万法列入了1997年出版的新的《食品卫生理化检验方法》的国家标准中，标准号为 GB/T5009.22-1996。

随着酶联免疫吸附分析法检测黄曲霉毒素B₁方法的成功建立，美国的朱繁生、Wild教授，日本的Tsuboi教授分别建立了黄曲霉毒素M₁的ELISA检测方法；匈牙利Barma-Vetro教授，我国的阳传和教授等建立了T-2毒素和玉米赤霉烯酮（F-2）的ELISA检测方法；朱繁生教授建立了赭曲霉毒素A的ELISA检测方法；Lou Jianlong建立了杂色曲霉素的ELISA检测方法；Mcery.w，Trucksess建立了脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的ELISA检测方法；Azcona-Oliver建立了腐马素毒素（PT）的ELISA检测方法；其中T-2毒素和DON的ELISA检测方法都被列入了我国的标准方法中，使我国的真菌毒素检验方法达到了国际先进水平，其标准号分别为GB/T14933-94，GB/T14929.5-94。

2.2 农药

现代农业的发展导致了农药的大量使用，随着人们生活水平的提高，对粮食和肉制品中由于食物链作用而残留的农药限量要求也越来越高，但传统的薄层层析和技术要求高的气相色谱已不适应这一要求，而ELISA法的高灵敏度及操作简便等优点使之在农药的检测方面得到了应用和发展。

农药主要有除草剂和杀虫剂两大类。90年代初对许多具有代表性的农药相继建立了ELISA检测方法，如在有机磷除草剂方面，Mc. Aclain和Hill针对杀螺松（FN），Erhard针对甲氟磷酸异己酶（soman）分别建立了ELISA检测方法。在有机氯方面，Newsome和Coldius针对2.4-D，Brady针对草不绿（alachor），Van Emon针对DDT分别建立了ELISA法。在氨基甲酸酯类杀虫剂和拟除虫菊酯类杀虫剂方面，Maro针对西维因（Carbary1），Bushway针对2-甲基苯井咪唑氨基甲酸酯（MBC），Ialk针对多菌灵，Sanber针对合成苄氯菊酯，Newsome针对克菌丹（captan），Goh针对西玛津（Simazine）都建立了ELISA方法，有些方法都已有了商品化的测试盒供应。

2.3 其它

ELISA法除了在真菌毒素和农药两大类物质上的应用外，近几年正逐步扩展到其它物质的检测上，如环境污染物。朱繁生教授在1989年建立了ELISA法检测藻类毒素的方法。Case George针对苯并（a）芘施建立了ELISA检测万法。

动物毒素如河豚毒素，植物毒素如罂粟碱、吗啡的ELISA法也正在研究和应用当中。

微生物如沙门氏菌，军团菌的ELISA的检测，1996年震惊世界的日本大肠杆菌O-157的 ELISA法检测也有报导。

动物抗生素如青霉素G在动物体和奶制品中的残留也有ELISA法检测的报导。另外，一些营养物质和食品添加剂如麸蛋白（Gliaclin），酱油蛋白（Soy protein），花生蛋白（Peanut protein），牛乳清蛋白（Bovine Wbey Protein），胭脂红酸（Carminic Acid）也建立了特异性较强的ELISA检测技术，用于食品的掺假检验。

随着食品工业的发展，对分析检测的要求越来越高，从而也使ELISA方法将更趋完善。一方面为提高 ELISA方法的灵敏度和特异性，制备单克隆抗体的技术将更加先进，而且稳定性也将更高；另一方面随着聚合酶链反应（PCR）技术的发展，将和ELISA法互相结合，从而使食品卫生分析达到DNA分子结构水平，促进食品工业的健康发展。

三、黄曲霉毒素分析方法概述

由于黄曲霉毒素具有毒性大。致癌力强、含量低（通常O-200μg/kg，即0-200ppb）和结构相似的特点，这就要求检测方法灵敏度高，特异性强，集分离与检测为一体，方可达到这样的要求。目前黄曲霉毒素的测定方法有多种，概括起来有化学分析法、仪器分析法、生物鉴定法及免疫分析法等。在这些分析方法中，主要是根据黄曲霉毒素的化学结构和生物学特性结合仪器来改进黄曲霉毒素的定性、定量分析方法，使之更加完善。例如利用黄曲霉毒素具有荧光性，从最初的薄层层析法（TLC）到薄层扫描仪法和高效液相色谱法（HPLC）；利用黄曲霉毒素能影响微生物、水生动物、家禽等生物体的细胞代谢，来鉴定黄曲霉毒素的存在，该方法专一性差，灵敏度低，一般只作为化学分析法的佐证；利用免疫化学的原理，从酶标记免疫吸附测定法（ELISA）到酶标记免疫吸附测定仪的研究。所有这些方法要根据不同的测定条件、目的来确定。上述这些分析方法也是紧密相朕的，它们之间没有绝然的分界线。例如化学分析法也要涉及到仪器，仪器分析法的前处理往往利用化学分析法的手段。为了叙述方便和突出重点，下面将介绍TLC、HPLC和免疫化学法，这也是目前研究较多、且受人们关注的几个代表性方法。

1、TLC法

TLC法是检测黄曲霉毒素的最常用方法，最初的TLC法是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂把黄曲霉毒素从样品中提取出来，经过层析净化，再在薄层板上展开层析、分离，利用 Aft. B₁的荧光性，根据荧光斑点的强弱与标准品比较测定其最低含量。TLC有单向展开和双向展开法。双向展开法能进一步除去样品中的杂质，提高了灵敏度，省略了柱层析等净化操作步骤。由于TLC方法测定黄曲霉毒素B₁不是很专一，样品中其它荧光物质的干扰，使其它杂质的Rf值与Aft.B₁一致，造成测定误差，要正确确定是否是黄曲霉毒素，常采用以下的方法：

（1）多种溶剂系统展开：佐佐木正兴等报道了采用11种不同溶剂系统展开时黄曲霉毒素B₁、G₁及各种黄曲霉毒素类似物的薄层层析图谱，可作为对照。

（2）层析斑点的化学试验：Andrellos等提出用衍生化的方法将黄曲霉毒素B₁与其类似物分开。将样品提取物用甲酸亚硫酸氯、醋酸亚硫酸氯或三氟醋酸处理，则黄曲霉毒

素能与其生成一种具有蓝紫色荧光的衍生物，而非黄曲霉毒素则不能生成衍生物。

（3）利用鸭雏、鸡胚等生物材料也可鉴别黄曲霉毒素和非黄曲霉毒素。

（4）层析斑点的物理试验：可根据紫外吸收光谱、红外吸收光谱和荧光光谱的差别，将非黄曲霉毒素和黄曲霉毒素分开。

为提高TLC分辨率，高效薄层层析法（HPTLC）已广泛应用于一些样品的黄曲霉毒素的测定，Coker认为：利用HPTLC法分析黄曲霉毒素可根据分析样品，改变各种分析条件，如溶剂（苯、乙腈、氯仿、CH₂Cl₂）、进样技术（自动、手动）、展开槽（饱和、非饱和）、检测方式（单色光、滤光片）等，以得到最佳效果。用双向HPTLC快速分析农产品中黄曲霉毒素，以苯一乙睛提取，无水乙醚初展，再以CHCL₃-二甲苯-丙酮展开，366mmm检测，可使B₁、B₂、G₁、G₂的检出限达0.8、0.4、0.7、0.4μg/kg。薄层扫描层析仪的出现，使TLC或HPTLC法实现了定性定量的自动化，而不需要目测最低黄曲霉毒素量，展开后可选择一定波长，以标准品作对照，直接测定 Aft.B₁的含量，使分析速度加快。

2、HPLC法

黄曲霉毒素的HPLC法主要用荧光检测器检测，反相C18柱，选择适宜的流动相，使多种黄曲霉毒素同时分离。如SimonellaA选用C18柱，乙酸-乙腈-异丙醇-水（1:5:5:39）为流动相，荧光检测器激发波长352mm；发射波长442nm，可分离测定Aft.G₁、B₁、G₂、B₂；Takahash则利用HPLC法同时分离测定Aft.、B₁、B₂、G₁、G₂、B_2a、G_2a6种组分，整个分析操作可以在 15min时完成。

3、免疫化学法

这种方法是利用免疫、酶及生化技术，开辟了黄曲霉毒素分析的新领域。目前应用的方法有：放射免疫法、酶联免疫法和亲和层析法。放射免疫法特异性强，灵敏度高，比较准确快速，操作简单，易于标准化，但也有严重的缺点，特别是需要特殊的设备和安全保护，妨碍了更广泛的应用。亲和层析液相色谱法，即用AftB₁单克隆抗体填充柱，用少量甲醇洗脱与黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂结合的抗体，在紫外辐射下检测其含量，检测量小于5μg。酶联免疫吸附法（ELISA）是70年代出现的新的免疫测定技术，其原理是抗原（或抗体）吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标记的抗体（或抗原）与标本中的待测物（抗原或抗体）起特异的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。1977年 Lawell将这一技术应用于黄曲霉毒素的测定，随后文献报道日渐增多，但大体为二类：一是用双抗体夹心法检测样本中的黄曲霉毒素，如Sashidha将黄曲霉毒素B₁-牛血清白蛋白涂覆于微滴定板池，经初步培养后，加兔的Aft.B₁抗体和游离Aft.B₁，用磷酸4-硝基苯酯作基质，以碱性磷酸酶-抗兔免疫球蛋白检测第一抗体的结合；二是用竞争法检测样本中的黄曲霉毒素，如在涂抗体的小孔中，用已烷萃取的黄曲霉毒素B₁，并与结合了辣根过氧化物酶的黄曲霉毒素B₁混合，室温下10min后，用水洗除去未结合的黄曲霉毒素共轭物，加底物，在405nm检测。为得到特异性更强的ELISA法，发展了Aft.B₁单克隆抗体的酶标记免疫吸附测定法，Kawamura用间接和直接竞争ELISA法分析Aft.B₁检出限小于1ng，为了使用方便，目前国内外已研制了酶标记免疫吸附测定药盒及配套仪器供检测单位使用。

4、HPLC、TLC、ELISA比较

综合上述文献资料，TLC、HPLC和ELISA三种分析方法是目前分析测定黄曲霉毒素的主要方法，不少研究者为此进行了比较，主要特点归纳如下（见表1）：

方法	TLC		HPLC	ELISA
方法	HPT	TLC	HPLC	多抗	单抗
特异性	±	±	±	+	++
灵敏度	0.4~4ppb	1~5ppb	0.02ppb	0.025~2.5ppb	＜1ppb
分析时间	长	长	短	短	短
样品处理	提取净化	提取净化	提取净化	提取	提取
样品测定数量/次	多	单	单	较多	较多
分离组分/次	多	多	较多	单	单

TLC法是常规法，一般实验室均可完成，但专一性不强，有其它荧光物质干扰，因此样品处理繁杂，要进行提取净化，分析时间较长，而且只能测定最低限量，不能精确测定样品中的含量，要正确确定Aft.B₁有时还要用其它分析方法作验证。HPLC法结合扫描仪，能够提高分辨率，使定量更为准确方便。

HPLC法是一个灵敏快速的方法，分辨率高，往往一次可同时测定多种黄曲霉毒素，可定性、定量，但仪器较昂贵，技术水平要求高，不宜推广使用，而且样品还需提取净化处理。

酶联免疫吸附分析法是近10～20年发展的新技术，若采用单克隆抗体的酶联免疫吸附分析法，具有特异性强，分析时间短的特点；而且其灵敏度与TLC或HPLC法相当或更高；样品前处理简单，提取后就可直接测定，不需要净化过程；一次可测定大量样本，并可制成定性、定量专用药盒，为黄曲霉毒素的分析提供了一条新途径。

四、酶联免疫吸附法检测黄曲霉毒素B₁

技术方法及特点

（一）基本原理

由于AFB₁是黄曲霉菌代谢产物中毒性最大，含量最高，分布范围最广的毒素，所以国内外对AFB₁的限量标准以及检测方法都作了严格的规定和深入的研究。ELISA法用于AFB₁的检测技术是新发展起来的较成功的方法。

ELISA法的基本原理是：将抗体吸附于固相载体（酶标反应板小孔）上，加入已经用酶标记的抗原与样品中的待测物（抗原）的混合物进行特异性的免疫反应，然后再加入酶的底物进行显色反应，通过颜色的深浅来判断样品中待测物的（抗原）含量。主要分间接法，夹心法和竞争法。

而AFB₁的检测是竞争ELISA方法，具体方法如下：

（1）将AFB₁特异性抗体吸附于酶标板小孔（固相载体）上，即包被过程。

（2）加入样品提取液（含AFB₁）和酶标AFB₁溶液的混合液，37℃温育反应0.5小时，清洗，即免疫反应。

（3）加入酶的底物溶液，37℃温育反应15分钟，底物产生颜色，颜色的深浅与酶的多少成正比，而酶的多少又与样品中的黄曲霉毒素B₁的含量成反比，因而可以通过底物显色后颜色的深浅来确定样品中黄曲霉毒素B₁含量，判定方法有目视法和仪器法。（详见产品使用说明书）

（二）操作步骤（大致操作步骤方框图如下：）

适量稀释清洗 37℃ 0.5小时 37℃ 15分钟仪器法

样品提取——试剂准备—免疫反应———显色反应———结果判定———计算含量

目视法

（三）定量检测

由我们公司研制的黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒是一种半定量检测试剂盒，但该测试盒在与酶标仪配套使用时，同样可以对黄曲霉毒素B₁进行定量检测。定量检测AFB₁主要有以下两种方法：

（1）标准曲线法

将浓度为 50ng/m1AFB₁标准溶液用A试剂（稀释液）稀释成0.01，0.1，0.5，1，5，10，20ng/ml的标准溶液梯度，设定为标准孔，在严格按照测试盒使用说明书操作显色后，在各孔中加入终止液，用黄曲霉毒素B₁测定仪或酶标仪在波长450nm处测定的吸光度A值，然后以浓度的对数值作横坐标，以各标准溶液的吸光度值A与浓度为零标准溶液的吸光度值A₀的比值作为纵坐标绘制标准曲线，操作方法及绘制标准曲线如图：

在检测样品时，测出样品孔的吸光度值A，通过标准曲线即可换算出样品中黄曲霉毒素B₁的含量，换算公式在说明书中有介绍。

（2）经验公式法（两点定量）

由于该测试金的标准曲线在0.1-10ng/ml浓度范围内线性较好，如果样品提取液经稀释后浓度大致在此范围内即可用经验公式法。经验公式法的操作方法是：

先用A试剂将测试盒中的标准液（B试剂）稀释10倍，配制成0.1ng/ml标准溶液，作为另一标准孔，按实验步骤操作，分别测出其吸光度A_0.1，A₁及样品孔的吸光度A值。按说明书上的公式计算出样品中黄曲霉毒素B₁的含量。操作方法如图：

（3）注意事项：

（a）由于测试盒中所配制的标准液的浓度为1ng/ml，如果您需要用标准曲线法检测黄典霉毒素B₁含量，请在购买时说明，我们将为您配制一瓶浓度为50ng/ml的AFB₁标准品，不过由于标准液的浓度比较高，请在使用时注意安全。

（b）在用标准曲线法检测不同批次的样品时，为了检测的准确性，每一次检测样品必须作一条标准曲线，因此用标准曲线法检测样品，包被板消耗很大，检测成本较高。为此，建议如无特殊需要，就尽量用经验公式法，其相对误差一般不超过10％。

（四）特点及注意事项

1．科学性：ELISA法检测AFB₁的研究是国家“八五”科技攻关研究课题，专家鉴定一致认为其研究成果总体上达到了国际先进水平。而利用该成果研制的快速检测试剂盒申报了国家发明专利，通过了产品的质量标准，并进行了商标注册。

2．合法性：目前，ELISA检测AFB₁的方法已作为国家技术质量监督局颁布的有关食品和饲料分析的标准方法，进出口商检和产品质检等执法检验部门也将把该方法列为行业标准。国外，AOAC早在八十年代就采用了该方法。

3．准确性：该方法灵敏度很高，比薄层法提高了近200倍；特异性强，其它荧光物质，色素，结构类似物对结果无干扰，而且回收率高，重复性。准确性好，与其它检测方法结果相吻合，并可以准确定量。

4．快捷性：与薄层层析繁琐的提取、纯化、浓缩、展开等步骤相比，ELISA法有了突破性的改进，提取方法简便，操作步骤省，测定时间仅需2小时，并可同时检测几十份样品，提高了工效，又节省了费用。

5．安全性：由于该方法的灵敏度高；所需的AFB₁标准溶液的浓度很低（仅1ppb），安全有了保障，并且也避免及减少了使用对人和环境有污染的有机溶剂。

6．应用面广：AFB₁是国家强制性卫生指标。在粮食、食品、饮料、酒类。饲料等行业中都应该检测其含量，目前，该测试盒在短短五年多的推广中，已有几千家单位使用了，应用范围扩大到除台湾外所有的省份和泰国、澳大利亚、新加坡等国家，从应用单位反馈的信息来看，ELISA法与薄层法相比，产生了质的飞跃。

7．注意事项

（1）由于ELISA方法中酶的活性较敏感，某些特殊样品，如葡萄酒类、含盐量高的酱油、腐乳类以及含脂量高的食用油等，在提取时要进行调PH值、脱盐、脱脂处理（详见产品使用说明书），以避免对酶活的影响，提高测定的准确性。

（2）整个实验过程中AFB₁浓度都很低，尽管安全性比薄层法有了很大的提高，但严格规范的化验操作过程不能忽视，接触AFB₁的容器仍需用次氯酸钠（NaClO）溶液浸泡后冲洗备用。

（五）建立酶联免疫检测方法的必要性

酶联免疫检测法建立之前，国家标准一直采用薄层层析法作为检测AFB₁的基本方法。几十年来，各级检验人员主要用这种方法对AFB₁的污染实施监测，但从上面几种方法的比较可以看出，这种方法的主要不足之处在于检测灵敏度不高和安全性较差。

动物实验的结果表明，AFB₁是已知毒性最强的天然物，毒理安全剂量仅为0.012μg/人/日，如果用半致死量比较，其毒性是氰化钾的10倍，因此，许多检验人员对AFB₁的检测存在心理障碍，不利于这项工作的开展。

另一方面，AFB₁是强剧毒性物质，单纯从毒理学的观念看待食品中的AFB₁，检出即视为有毒。薄层层析法的检测灵敏度只是5ppb，与毒理学的检毒要求差距甚远，而且，目前执行的食品中AFB₁允许量标准（GB 2761-81）只是个非安全性标准，为了保障人民健康，有关部门将根据国情变化逐步修订这一标准，使其在现实可行的基础上尽量从严，以提高该标准的安全性。因此，即使从近期的发展来看，薄层层析法也会因其灵敏度差而随着允许量标准的降低逐步被淘汰。

酶联免疫技术是目前定量检测真菌毒素最实用的方法。新版国家标准（GB/T5009.22 -1996）采用的酶免疫法对AFB₁的最低检出浓度为0.01μg/kg，比薄层层析法灵敏度高几百倍，而且，由于抗体抗原之间的特异性反应。定性定量分析等于同时完成，所以对呈现阳性结果的样品不必再作确证实验。在样品提取时，也因此适当简化了反复纯化、分离的步骤。此外，用酶联免疫法检测AFB₁时，使用的标准品浓度只有1μg/kg，远远低于WHO规定的15μg/kg的安全限量，与薄层层析法相比酶联免疫法的安全性要提高很多。从以上的分析来看，新版的国家标准引入酶联免疫检测技术后，使检测AFB₁的准确性、安全性、实用性都有很大程度的提高。作为黄典霉毒素B₁检测试剂盒的研制单位，江苏省微生物研究所暨无锡市生物技术公司将配合有关部门努力推广这项技术，为进一步加强对AFB₁污染的监测和控制作出贡献。我们拥有坚实的科研力量，高素质的科研人才，凭着严谨的科研态度，以质量第一，服务至上为宗旨，为广大使用单位提供产品和技术咨询、免费培训，并希望能和使用单位合作，研制其它产品，为提高我国的分析化学水平贡献一份力量！